Diagnóstico Genético Pré-implantacional PGS e PGD (PGT-A e PGT-M)

O PGT (Teste Genético Pré-Implantacional) pode ser realizado no processo de fertilização in vitro (FIV), com o objetivo de diagnosticar nos embriões a existência de alguma doença genética, antes da implantação no útero da mãe. Assim, casais com chances de gerar filhos com problemas genéticos como Síndrome de Down (trissomia do cromossomo 21), Síndrome de Patau (trissomia do cromossomo 13), Síndrome de Edwards (trissomia do cromossomo 18), Síndrome do Klinefelter (47XXY), distrofia muscular, hemofilia, entre outras anomalias genéticas, podem descobrir se o embrião possui tais doenças por meio deste exame.

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QUEM SE BENEFICIA DO PGT?

O PGT pode ser recomendado para todos os casais, mas a principais indicações são para casais com mulheres com idade avançada (mais de 40 anos – alguns recomendam após os 38) ou quando um dos parceiros do casal tiver alterações cromossômicas avaliadas pelo exame cariótipo, como as translocações, inversões ou polimorfismos. A importância destes três últimos vai depender do histórico reprodutivo de cada paciente como, por exemplo, tempo de tentativas de gravidez, abortos e falhas em tratamentos anteriores. Casais com doenças genéticas na família causadas por genes específicos também têm indicação do teste.

Quanto a idade materna, à medida que a mulher envelhece, aumentam também as chances de gerar um embrião cromossomicamente alterado, não importando o número de embriões fertilizados.

A translocação cromossômica é uma anomalia cromossômica causada pelo rearranjo de partes entre cromossomos. Existem dois tipos principais: a translocação recíproca, também conhecida como não-Robertsoniana e a translocação robertsoniana. Além disso, as translocações podem ser balanceadas (sem perda ou acréscimo de material genético) ou não-balanceadas (quando a troca de material cromossômico é desigual resultando em genes extras ou ausentes).

A inversão cromossômica é a ocorrência de duas quebras em um cromossomo e a soldadura em posição invertida do fragmento ao restante do cromossomo. A inversão é dita paracêntrica se as quebras ocorrerem em um mesmo braço cromossômico, e é denominada pericêntrica se o fragmento cromossômico invertido incluir o centrômero.

Polimorfismo cromossômico são alterações da estrutura cromossômica (as mais importantes são as alterações da heterocromatina).

A BIÓPSIA EMBRIONÁRIA

Para se realizar o PGT, é necessário inicialmente fazer uma biópsia do embrião. A biópsia embrionária é realizada na fase de blastocisto, ou seja, no quinto dia após a fecundação (120 horas), o que permite avaliar um número maior de células (de 6 a 10) e, consequentemente, obter um resultado mais preciso. O procedimento consiste na retirada de células do trofectoderma do embrião, ou seja, a região externa formada por células que vão originar as estruturas da placenta e membranas.

A retirada das células embrionárias ocorre após a realização de uma pequena abertura na região externa do blastocisto. Algumas células que se exteriorizam por essa abertura são delicadamente aspiradas e encaminhadas ao laboratório de genética. É muito importante que a biópsia seja realizada de maneira correta para que não comprometa o desenvolvimento do embrião no futuro. Ressaltamos que a biópsia não afeta massa celular interna, ou seja, porção do blastocisto que originará o feto propriamente dito, não prejudicando o futuro bebê.

PGT-A, PGT-M E PGT-SR: NOVAS SIGLAS PARA DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL

Há algum tempo a maioria das clínicas utilizava a sigla PGS para definir o screening genético pré-implantacional, referindo-se ao rastreamento dos 24 cromossomos na amostra de células do embrião biopsiado durante o tratamento de FIV. Estas siglas haviam sido adotadas para substituir a terminologia anterior PGD que, então, passou a ser utilizada somente para o diagnóstico genético pré-implantacional para doenças monogênicas. Esta sopa de letras frequentemente gerava confusão. Por isso, para facilitar o entendimento e padronização, o diagnóstico genético pré-implantacional passa a ser tratado por todos como teste genético pré-implantacional (PGT), e são agregados complementos associados ao tipo de diagnóstico genético em questão:

• PGT-A: lembre-se A de aneuploidia, ou seja, o diagnóstico que identifica a saúde cromossômica do embrião. Este estudo é realizado para ajudar a oferecer um tratamento de FIV mais efetivo, pois permite identificar o embrião saudável com possibilidade ampliada de implantação e risco reduzido de abortamento e doenças cromossômicas como a Síndrome de Down, que estão principalmente relacionadas com a idade materna avançada e alterações no cariótipo do casal. Também é indicado em casos de abortos de repetição sem outra causa. Teoricamente, evitar a transferência de embriões alterados reduzirá o risco de complicações relacionadas ao insucesso da gravidez e aumentará a probabilidade de conceber uma gravidez viável.
  
• PGT-M: lembre-se M de monogênica, no qual o diagnóstico do embrião tem o objetivo de identificar aqueles que foram afetados por uma alteração genética específica herdada dos pais e que dá origem a uma doença hereditária. É um estudo indicado para famílias onde existem casos de doenças monogênicas hereditárias, tais como anemia falciforme e fibrose cística, entre outras. O objetivo do PGT-M é estabelecer uma gravidez que não será afetada por características genéticas específicas, como uma mutação genética conhecida, presente em um ou ambos os pais. Também é usado para selecionar embriões para transferência que possuam características específicas, como um tipo complexo de antígeno leucocitário humano compatível com um irmão afetado por doença cujo tratamento efetivo seja o transplante de células-tronco.
  

• PGT-SR: PGT-SR: teste para pesquisa de rearranjos cromossômicos estruturais como, por exemplo, as translocações. Os três principais tipos de rearranjos são: translocações recíprocas, translocações robertsonianas e inversões. A translocação mais comum em humanos envolve os cromossomos 13 e 14 e é observada em cerca de 0,97/1000 recém-nascidos, mas existem outras consideradas importantes e que devem ser avaliadas caso a caso. O objetivo do PGT-SR é estabelecer uma gravidez que não seja afetada por essas anormalidades em um casal com uma translocação equilibrada ou deleção/duplicação. Rearranjos cromossômicos podem ser herdados ou podem ocorrer espontaneamente. Muitos portadores de rearranjos cromossômicos balanceados são saudáveis e desconhecem o status de portador até que tentem ter filhos.
  Os portadores de rearranjos equilibrados correm o risco de produzir embriões com a quantidade incorreta de material cromossômico, o que normalmente não leva a uma gravidez bem-sucedida. O PGT-SR pode ajudar a identificar embriões com a quantidade correta de material cromossômico com maior probabilidade de levar a uma gravidez bem-sucedida e a um nascimento saudável. A abreviação t(A;B)(p1;q2) é usada para denotar a translocação entre um cromossomo A e um cromossomo B. A informação no segundo conjunto de parênteses, quando fornecida, indica a localização precisa no cromossomo para os cromossomos A e B respectivamente – com p indicando o braço curto do cromossomo, q indicando o braço longo e os números após p e q se referindo às regiões, bandas e sub bandas quando os cromossomos são corados e observados em um microscópio. A biópsia embrionária é um procedimento de retirada de células do embrião (trofectoderma) que vão originar as estruturas da placenta, para análise genética ou cromossômica. É muito importante que a biópsia seja realizada de maneira correta para que não comprometa o desenvolvimento do embrião no futuro.
• PGT-P: lembre-se P de Poligênica O exame PGT-P é um teste para doenças poligênicas indicado para a análise de embrião antes da transferência do embrião para o útero.
• Este teste genético é realizado em biópsias de embriões e projetado especificamente para identificar o risco de certas doenças genéticas.  O exame PGT-P é uma ferramenta de triagem usada para ajudar a selecionar qual (is) embrião (es) devemos transferir para o útero com o objetivo de ter uma gravidez cada vez mais segura e um bebê com uma condição genética ideal. Este teste é projetado para rastrear várias condições ao mesmo tempo. O objetivo do PGT-P é encontrar embriões com menor risco para o desenvolvimento de doenças poligênicas e tem o intuito de determinar um risco, mas não um diagnóstico. 
• As principais doenças poligênicas pesquisadas são:
• Câncer de Próstata
• Melanoma Maligno 
• Carcinoma Basocelular
• Esquizofrenia
• Doença Arterial Coronariana
• Hipercolesterolemia
• Hipertensão 
• Risco de Ataque Cardíaco

AS PRINCIPAIS INDICAÇÕES

O PGT-A está indicado nas seguintes situações:

• Casais com alterações no cariótipo que apresentam risco elevado de alteração cromossômica na prole;
• Idade materna avançada;
• História familiar de doenças cromossômicas;
• Antecedente de filho com alteração cromossômica;
• Cariótipo alterado de pelo menos de um dos membros do casal (translocação, inversão ou polimorfismo);
• Falhas de tratamentos prévios de FIV;
• Aborto de repetição.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Normal:

Um resultado normal indica a presença de 46 cromossomos completos, incluindo 22 pares de autossomos e um par de cromossomos sexuais. Um resultado normal será reportado se 2 cromossomos para cada autossomo (1 até 22) e 2 cromossomos sexuais forem encontrados.

Monossomia:

Estado no qual um cromossomo de um par normal é ausente. A maioria das monossomias não é compatível com a vida. Será relatada se houver qualquer cromossomo ausente. O relatório vai mostrar um “-” antes do autossomo afetado (cromossomos 1-22) e “anormal” no campo de resultado.

Trissomia:

Estado no qual um cromossomo de um par normal está duplicado. A maioria das trissomias não é compatível com a vida. Trissomia será relatada se existirem cromossomos extras detectados. O relatório vai mostrar um “+” antes do cromossomo autossomo extra (cromossomos 1-22) e “anormal” no campo de resultado.

Deleção/Duplicação Parcial (del/dup):

Indica que uma parte de um cromossomo está ausente ou adquirida. Deleções e duplicações diagnosticadas em um feto ou em nascidos vivos são geralmente associadas com anomalias físicas ou cognitivas. O relatório vai mostrar um “- / + p ou q” com a região do cromossomo que é deletada ou duplicada, respectivamente.

Anormal Complexo: Uma amostra embrionária será classificada como anormal complexa se houver uma combinação de cinco ou mais achados anormais, incluindo monossomia, trissomia e duplicação/deleção

Ausência de resultado:

Algumas vezes, apesar das tentativas de análise em milhões de loci genômicos, alguns cromossomos podem não produzir sinais confiáveis. Quando não é possível a obtenção de um resultado com confiança elevada, aparecerá “ausência de resultado”, não sendo possível a informação cromossômica dessa amostra.

NICS – ANÁLISE NÃO INVASIVA DO EMBRIÃO

Entre os avanços tecnológicos que estarão em pauta, destacamos a possibilidade do teste genético pré-implantacional não invasivo (nicsPGT). É um método Não Invasivo de Screening Cromossômico (NICS) baseado no sequenciamento do DNA genômico secretado no meio de cultura a partir dos blastocistos. Esta nova avaliação genética do embrião ainda está em estudos e não está validada. Ela combina a análise cromossômica do DNA livre de células do embrião e sequenciamento SNP. O DNA livre de células identificado no meio de cultura é uma mistura do DNA do embrião e materno, o que aumenta a complexidade do diagnóstico de embriões mosaicos.

A vantagem quando se compara ao PGT clássico e já conhecido, é não ser necessária a retirada de células do embrião e, por isso, é uma técnica não invasiva, ainda é considerada experimental e, no momento, não substitui a biópsia embrionária (PGT-A). Vamos aguardar o futuro.

COMO O PGT-A MELHORA AS TAXAS DE SUCESSO NOS TRATAMENTOS DE FIV?

PGS demonstrou inúmeros benefícios, entre eles:

• Reduz o tempo para se alcançar uma gestação, diminuindo número de ciclos de FIV.
• Reduz o risco de abortos, já que a maior parte das perdas se deve às alterações do número de cromossomos.
• Aumenta a chance de implantação do embrião e o sucesso de dos tratamentos.
• Reduz o risco de gestações múltiplas pela transferência eletiva de um único embrião. (sET)

Veja as estatísticas apresentadas abaixo:

CUIDADOS E REFLEXÕES NAS INDICAÇÕES DO EXAME (O “FALSO POSITIVO”)

Apesar de seus benefícios, este exame pode apresentar resultado “falso positivo”, ou seja, indicar que o embrião é alterado, quando na verdade é normal, o que levaria ao descarte de um embrião saudável. Esta possibilidade de “falso positivo” ou “falso negativo” é possível e previsível neste tipo de exame. Em outras palavras, o exame PGT pode levar a um tratamento mais eficiente por minimizar as possibilidades de anomalias no bebê e aumentar a probabilidade de resultados positivos na FIV, pois a maioria dos embriões com anomalias não chega a implantar ou termina em aborto no início da gestação e é esperado que parte dos embriões formados na FIV sejam anormais (não saudáveis), sendo uma importante causa de falha de FIV. Por outro lado, um ensaio clínico realizado por Scott et al demonstrou que a possibilidade de “falsos positivos” podem ocorrer em até 4% dos casos e tornar o tratamento menos eficaz. Se houver falso positivo, podemos descartar a única chance de a paciente engravidar. Alguns estudos demonstram que este número pode chegar até a 20% (Paulson).

QUAL A DIFERENÇA ENTRE EFICIÊNCIA E EFICÁCIA?

A diferença entre eficácia e eficiência é que enquanto a eficácia refere-se a fazer a tarefa certa, completar atividades e alcançar metas, a eficiência é sobre fazer as coisas de forma otimizada, de maneira mais rápida ou com menos gastos. Em termos gerais:

Eficaz: é algo adequado para atingir um propósito, de modo a alcançar o resultado pretendido ou esperado.

Eficiente: quando a tarefa é executada da melhor maneira possível, com o menor desperdício de tempo, esforço e recursos.

Para alguns autores, o PGT-A torna o tratamento mais eficiente, pois selecionamos o embrião com mais chance e poupamos a paciente de transferir embriões que não implantariam por serem alterados. Entretanto, em algumas situações, pode tornar o tratamento menos eficaz, ou seja, com um pior resultado final.

Um dos motivos disso é o fato da biópsia ser realizada na porção do embrião que originará a placenta, onde pode ocorrer mosaicismo, ou seja, haver células alteradas entre as normais, e esta alteração nem sempre se refletir no embrião. Mosaicismo é a presença de duas ou mais linhagens de células com diferentes constituições cromossômicas.

Além disso, alguns estudos levantam ressalvas sobre uso do PGT-A. Orvieto et al, no congresso ESHRE de 2014, demostraram que 20% dos casos de PGT-A foram inconclusivos na biópsia e mais 16% apresentavam mosaicismo. Esfandiari et al demonstraram algumas discrepâncias no resultado de PGT-A do mesmo embrião, enviado para diferentes centros. O mesmo embrião teve resultado normal ou alterado quando o exame era realizado em clínicas diferentes. Há, ainda, alguns relatos publicados de transferência de embriões considerados aneuploides pelo PGT-A que levaram a uma gravidez saudável. Com o avanço das técnicas de avaliação das biópsias embrionárias com novos protocolos de NGS, os resultados estão mais precisos atualmente, mas ainda há chance de erros. Estima-se que mosaicismo pode estar presente em 4 a 5% dos embriões biopsiados.

Frente a tudo isso, alguns autores vêm ponderando a realização indiscriminada do exame, principalmente em pacientes com baixa resposta na estimulação ovariana, pois produzem menos óvulos e menos embriões, às vezes, um único embrião.

Outra preocupação é se realmente a biópsia embrionária é inócua para o embrião. Apesar de ser considerada segura, alguns autores questionam se pode afetar as chances do embrião. Um estudo randomizado (Munné et al, 2019) comparou transferências únicas de embriões congelados: um grupo tendo realizada PGT-A e outro sem o exame. Para pacientes abaixo de 35 anos, a taxa de gravidez em curso foi semelhante (49,5% para PGT-A e 53% para grupo controle). Considerando que, neste grupo de pacientes, somente 48% dos embriões eram normais na biópsia, esperava-se uma maior taxa de gravidez no grupo que realizou a biópsia, o que não foi observado, questionando-se se a vantagem de selecionar embriões euploides não foi balanceada por prejuízo causado pela biópsia. Concluiu-se, assim, que nesse grupo de pacientes, o PGT-A não mostrou benefício. Nesse mesmo estudo, também foram avaliadas pacientes entre 35 e 40 anos. Nesse grupo, houve uma taxa de embriões euploides de 35,5% e houve um aumento na taxa de gravidez em curso com a biópsia (51%), em relação aos controles (37%), mostrando benefício da biópsia em pacientes com mais risco de aneuploidia. Nesse estudo, não houve alteração na taxa de abortos com a biópsia

PPor tudo isso, PGT-A não deve se tornar um procedimento de rotina para todas as mulheres que desejam engravidar. Antes de mais nada, existem alguns princípios éticos do casal que devem ser respeitados, como a aceitação de uma seleção natural e a não concordância do descarte dos embriões que apresentarem problemas. Além disso, há o custo envolvido e o fato de não ser isento de riscos, como por exemplo resultados falso positivos, o que poderia levar a descarte de embriões com chance de uma gravidez saudável.

TIPOS DE MOSAICISMO

Um embrião é considerado “mosaico aneuploide” quando há mais que um tipo celular. Na biópsia enviada, o nível de mosaicismo pode variar a cada biópsia e é possível que não represente o nível de mosaicismo do embrião como um todo. A presença de mosaicismo em uma biópsia de trofectoderma indica maior risco de que o embrião seja verdadeiramente mosaico. Baseado na nossa própria validação interna do teste PGT-A por NGS, as amostras de mosaicos podem ser reportadas como:

Mosaico aneuplóide de baixo grau
Baseado na nossa própria validação interna do teste PGT-A por NGS, a Igenomix reporta amostras com “baixo grau de mosaicismo” quando há mais de 30% e menos de 50% de células aneuploides na biópsia.

Baseado na nossa própria validação interna do teste PGT-A por NGS, a Igenomix reporta amostras com “alto grau de mosaicismo” quando há mais de 50% e menos de 70% de células aneuploides na biópsia.

MOSAICISMO: A GRANDE QUESTÃO

Mosaicismo é a presença de dois ou mais tipos de linhagem celular com diferentes cromossomos no mesmo embrião. Pode ser dividido em baixo grau (mais de 30% e menos de 50% de células aneuploides na biópsia) ou alto grau (mais de 50% e menos de 70% de células aneuploides na biópsia).
O mosaicismo sempre existiu e vai continuar existindo, mas o avanço das tecnologias, novos protocolos de NGS (sequenciamento de nova geração) e a bioinformática, estão possibilitando uma melhor compreensão desse tema.
Veja no próximo capítulo alguns exemplos de como o mosaicismo pode se manifestar.

EM QUE SITUAÇÕES O IPGO RECOMENDA A BIÓPSIA EMBRIONÁRIA?

O IPGO considera aceitável a indicação em pacientes com histórico familiar de
anomalias cromossômicas, cariótipo alterado de um dos membros do casal, abortos repetidos, falhas repetidas de tratamentos anteriores sem explicações e mulheres com idade avançada que produzam uma quantidade “razoável” de óvulos (mais que 38 anos).

A GRANDE QUESTÃO: E AGORA? TRANSFERIR OU NÃO UM EMBRIÃO MOSAICO?

Dependendo do cromossomo envolvido nos casos de mosaicismo, a transferência pode ou não ser indicada. Diante desses casos, é importante seguir as recomendações da Sociedade Internacional de Diagnóstico Genético (PGDIS). Para simplificar o entendimento sobre os riscos envolvidos e recomendações sobre a transferência compartilhamos abaixo:

Não existe uma resposta simples para a questão da transferência do embrião mosaico ao útero materno, porém, existem alguns recursos que podem ajudar na decisão conjunta entre médicos e pacientes.

Há novas discussões sobre as taxas e porcentagens de mosaicismo. As publicações mais recentes têm demonstrado que, com a evolução do diagnóstico, as taxas encontradas nos embriões estão em torno dos mesmos 5% encontrados em material de aborto estudado, revelando o real diagnóstico com a nova tecnologia.

Recentemente, após inúmeras validações e quase dois anos de estudos, novos protocolos de diagnóstico para aneuploidias embrionárias foram aprovados para a utilização clínica.

Com isso, começou uma nova era, com novos resultados do teste genético pré-implantacional para aneuploidias PGT-A (PGS). Uma nova versão do estudo cromossômico do laboratório de genética reprodutiva, Igenomix, é capaz de demonstrar, nos casos de análise de biópsia de blastocistos, a possibilidade de novos diagnósticos, tais como mosaicismo.

EMBRIÕES COM MOSAICISMO PODEM SER CONSIDERADOS NORMAIS?

Apesar que certos níveis de mosaicismo talvez não apresentem riscos para o desenvolvimento seguro do embrião, quando se trata de saúde, é preciso ter cuidado e envolver os pacientes em uma decisão dessa dimensão e importância. Não existe resposta padrão para o dilema de transferir um embrião com mosaicismo e arriscar a saúde de um futuro bebê, mas, sim, protocolos e referências baseados em evidências científicas para orientar a família e os especialistas nessa escolha. Especialistas de todo o mundo estão debatendo esta questão e, recentemente, a PGDIS, Sociedade Internacional que reúne especialistas e estudos sobre o diagnóstico genético pré-implantação, publicou posição sobre o mosaicismo cromossômico identificado em embriões em estágio de blastocisto.

O objetivo de obter o sucesso dos tratamentos de reprodução humana é comum para os pacientes, clínicas de reprodução assistida e laboratórios de genética. Quando a análise de embriões de casais que normalmente não estão em seu primeiro ciclo de fertilização in vitro obtém como resultados somente embriões alterados por mosaicismo, o que muitos se perguntam é se interromper o tratamento é a única solução ou se, pelo contrário, a autocorreção celular de mosaicismo é uma realidade e os casais deveriam ter a chance de optar pela transferência embrionária.

RECOMENDAÇÕES E POSICIONAMENTO DA PGDIS (PREIMPLANTATION GENETICS DIAGNOSIS INTERNATIONAL SOCIETY) SOBRE O MOSAICISMO DE EMBRIÕES EM ESTÁGIO DE BLASTOCISTO

• Transferir embriões onde são identificadas aneuploidias de mosaicismo, ou seja, algumas células possuem aneuploidias e outras não, deve ser cogitado apenas quando não existem embriões euploides, ou seja, cromossomicamente normais.
• Para detectar com segurança o nível de mosaicismo é preciso que a biópsia embrionária extraia, de preferência 5 células, e que seja feita com o mínimo dano possível.
• É preciso que o laboratório de genética conte com uma plataforma de NGS validada que possa avaliar o nível de mosaicismo das células.
• Níveis de mosaicismos inferiores a 20% podem ser considerados normais e níveis maiores de 80% devem levar a um diagnóstico de embrião aneuploide, que não deveria ser transferido.
• Níveis de mosaicismos entre 20%-80% devem ser analisados individualmente, envolvendo especialistas da clínica de reprodução assistida, laboratório de genética e também os pacientes.
• Entre os embriões mosaicos para euploide/monossomia ou mosaico para euploide/trissomia, priorizar embriões euploide/trissomia, pois a maioria das
• monossomias, com exceção de 45,X não evoluem. Além disso, é importante considerar, entre opções de embriões com trissomia, qual é o cromossomo alterado para tomar a decisão (eliminar trissomias com 13,18,21).

Pacientes sempre devem estar envolvidos e conscientes dos riscos da transferência de embriões com mosaicismo e contarem com um aconselhamento genético para tomar uma decisão. Além disso, o acompanhamento de um pré-natal rigoroso, incluindo testes como NIPT (Diaou até amniocentese, deve ser considerado a partir da 14ª semana de gestação.

Para acessar a publicação completa com todas as recomendações para clínicas e laboratórios de genética acesse o Newsletter PGDIS.

PGT-M : DETECÇÃO DE GENES ESPECÍFICOS

Quando um casal tem história familiar de alguma doença relacionada a algum gene específico, deve-se criar uma “sonda” específica para aquela família, a partir de amostra do sangue dos pais. São inúmeras as doenças possíveis de serem diagnosticadas (listadas abaixo). Pode-se ainda pesquisar compatibilidade HLA no embrião.

Hoje, o Conselho Federal de Medicina permite que esta técnica seja utilizada para selecionar embriões compatíveis com outro filho do casal que tenha alguma doença que necessite de transplante ou células-tronco como tratamento.

Essa técnica pode ser utilizada em conjunto com o PGT-A.

Este texto foi extraído do e-book “BIÓPSIA EMBRIONÁRIA NA FIV”.
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