a-SNP*- AP com Apoio Parental é uma técnica em Fertilização in vitro para o Diagnóstico genético do embrião (PGD) – *SNP (Single Nucleotide Polymorphism – array)
Segundo o diretor do IPGO, Dr. Arnaldo Cambiaghi, o sucesso de um tratamento de fertilização assistida não é simplesmente um teste de gravidez positivo, mas a garantia de se ter um bebê único e saudável. Ele lembra de que nada adianta alcançar uma gestação única, gêmeos ou trigêmeos em um tempo curto se o tratamento e a gravidez tiverem complicações, a criança apresentar problemas de saúde e a mãe correr riscos de comprometimento da sua saúde durante o tratamento a que estiver sendo submetida.
Diagnóstico genético pré-implantacional (PGD)
Diagnóstico Genético Pré-implantacional (PGD) é um teste genético, especializado, utilizado na fertilização in vitro (FIV) para avaliar uma ou mais células do embrião com o objetivo de verificar se há anormalidades cromossómicas e/ou doenças genéticas devido a uma mutação de um gene. Tem sido indicado para casais nos quais a mulher tenha idade avançada ou abortos repetidos e quando um dos cônjuges apresenta anomalias cromossômicas.
Neste exame, cada embrião, a partir de um ciclo de FIV é testado separadamente. Os embriões com resultados normais podem ser selecionados para a transferência para o útero da mãe. O PGD pode ser realizado tanto no terceiro dia após a fertilização e, neste caso, uma única célula denominada blastômero é retirada de cada embrião; ou no quinto dia após a fertilização, quando algumas células (cinco a oito) do trofoectoderma de cada embrião são retiradas e enviadas ao laboratório para análise.
“Os embriões permanecem no Centro de Reprodução Humana aguardando os resultados dos testes. O IPGO indica a biópsia no dia 5, fase de blastocisto, pois, nesta fase de desenvolvimento, já existe uma seleção dos melhores embriões e, por isso, o exame é mais preciso, uma vez que avalia um número maior de células”, diz o médico.
Os exames atuais para o Diagnóstico Genético Pré-implantacional – 1ª e 2ª gerações
FISH (Fluorescence In Situ Hybrydization) – 1ª geração: foi a primeira técnica de diagnóstico genético pré-implantacional e consiste em marcar os cromossomos com uma substância fluorescente. Na presença dos cromossomos estudados, eles emitem uma luz visível que permite detectar a presença ou ausência do cromossomo, mas não a sua forma ou diminuição/ganho de material genético, nem consegue avaliar doenças gênicas (devido à mutação de um gene), só mesmo as alterações estruturais. Na rotina, esta técnica só é indicada quando se deseja pesquisar alterações numéricas de no máximo 11 cromossomos: 13, 14, 15,16, 17, 18, 20, 21, 22, X e Y. Cambiaghi alerta: “Uma vez que as sondas são individualizadas, seria necessária uma sonda para cada cromossomo para que os 24 cromossomos fossem avaliados. Isto torna o custo financeiro deste procedimento inviável”.
a-CGH (Comparative Genomic Hybridization-array) – 2ª geração: técnica que traduzida para o português recebe o nome de “Hibridação Genômica Comparativa por Microarranjos” é ainda, nos dias de hoje, a mais aceita e realizada pelas clínicas de reprodução humana. Baseia-se na ligação de sondas específicas que avaliam a expressão gênica lida por softwares (array), em regiões do cromossomo previamente sabidas e planejadas (a maioria dos genes conhecidos). Antes de serem analisadas, o DNA das células é submetido a amplificação de genoma, o que resulta em milhares de dados de cada cromossomo (WGA – Whole Genome Amplification). Quando essas sondas se ligam, emitem uma luz que é detectada por um software de “leitura genética” que interpreta se houve ganho ou perda de material genético. Como se fosse um gabarito que deveria ser encaixado no lugar certo.
“Em palavras simples seria como ter 100 calças (seus genes, cromossomos) que combinam com 100 blusas (as sondas). Quando são colocadas lado a lado, percebe-se que as peças não batem, pois estão faltando algumas calças ou algumas blusas. Diferente do exame anterio, podem ser pesquisadas alterações numéricas nos 24 cromossomos e ainda como vantagem, em uma mesma biópsia, pode se realizar um estudo genético. No exame cromossômico, os embriões não precisam ser congelados, pois o resultado sai em tempo hábil para que a transferência embrionária seja realizada no mesmo ciclo”, conta Cambiaghi.
Entretanto, Cambiaghi alerta que esta não representa uma grande vantagem, uma vez que se considera que o endométrio é mais receptivo sem a ação hormonal e a vitrificação dos embriões praticamente não interfere na qualidade.
a-SNP com apoio parental (a-SNP -AP) – 3ª geração: O PGD pela técnica de a-SNP com Apoio Parental – (a-SNP- AP ou a-array e SNP = Single Nucleotide Polymorphism e Apoio Parental = amostra de sangue dos pais) é uma nova tecnologia em PGD que utiliza amostras de DNA dos pais biológicos, a qual é usada como referência para testar, interpretar e comparar as amostras e aumentar a precisão dos resultados. Os embriões têm as amostras celulares colhidas e enviadas ao Laboratório Natera nos Estados Unidos para o estudo genético. Como a análise genética demora alguns dias em decorrência do transporte, os embriões deverão ser vitrificados e transferidos em um ciclo futuro. “Friso novamente que o congelamento de embriões pela técnica de vitrificação não traz nenhum prejuizo à qualidade dos mesmos e pode ainda melhorar a taxa de implantação por se conseguir um endométrio mais receptivo, uma vez que não sofrerá a ação hormonal ‘exagerada’ proveniente da indução da ovulaçao”, afirma o médico.
Ele explica que o que esse novo teste tem de único é a combinação da análise genética do embrião com a dos pais, o que ajuda a corrigir possíveis erros de análise da técnica a-CGH. Todas as análises são realizadas por biologia molecular e bioinformática de última geração (inferência Bayesiana), que determinam o número de cópias de cada cromossomo com a probabilidade de acerto. O a-SNP utiliza uma plataforma mais avançada do que a do CGH para a análise e por isso detecta os polimorfismos no embrião estudado. Os polimorfismos são pequenas variações de um sítio pequeno e específico do DNA. “São eles que nos dão nossas características individuais, já que 99,9% do nosso genoma são iguais. Já são conhecidos mais de 50 milhões de polimorfismos na nossa espécie”, completa o médico.
Por essa característica, o a-SNP-AP consegue, além de detectar perdas e ganhos de material genético da mesma forma que o a-CGH, identificar outras alterações. “Comparando com o exemplo anterior das calças e blusas, além das peças combinarem podem ser identificadas pequenas alterações como um botãozinho ou se a combinação está correta, o que diferencia de quem é a blusa e onde ela se encontra. O diferencial desta técnica é que se houver alterações cromosômicas, poderá ser identificado se a origem da anormalidade é do pai ou da mãe, o que pode ser útil em algumas situações. O a-CGH nãopermite esta identificação”, enfatiza Cambiaghi.
Comparando o a-CGH e o a-SNP-AP
Os estudos comparativos ainda são poucos mas um deles demonstrou em 8.816 embriões biopsiados que 2.492 seriam diagnosticados como normais pelo a-CGH, entretanto, 213 destes seriam anormais por esta nova técnica. Neste estudo, o a-SNP-AP poderia identificar até 8,5% a mais de alterações não diagnosticadas pelo a-CGH. (GSN internal blastomere biopsy data from May 2009 to november 2010 **Expected detection by a-CGH based on a-CGH technical inability to detect Haploidy, XXX triploidy and UPD).
Falso Negativo e Falso Positivo
Este é um dado extremamente importante. Qualquer exame está sujeito a erros previstos chamados de “falsos positivos” ou falsos negativos” e existem porcentagens esperadas para cada técnica. O a-CGH tem risco aproximado de 1% (um por cento) a 5% (cinco por cento) para um embrião ser diagnosticado como normal quando, na verdade, ele não é (falso negativo) e o a-SNP-AP é de aproximado 2,1%. Aproximadamente, 7% (sete por cento) a 10% (dez por cento) dos embriões podem ser considerados anormais quando, de fato, eles são normais (falso positivo) e o a-SNP-AP é de 3,8%.
Dissomia uniparental (UPD)
Dissomia Uniparental é a presença de duas cópias de um determinado cromossomo proveniente de um dos pais, e nenhum do outro. Neste caso, a célula é dissômica para o dado cromossomo. Portanto, em algumas situações especiais, mesmo o embrião que tem características cromossômicas aparentemente normais pelo a-CGH, pode estar alterado. Um determinado par de cromossomos pode, o invés de ter um cromossomo da mãe e um do pai, que é o normal para todos os indivíduos, ter os dois pares só de um deles : os dois só do pai ou os dois só da mãe. Um alelo ou todo o cromossomo de um dos pais está faltando e por isso o nome uniparental (quando ambas as cópias herdadas são somente de um dos pais). Isso pode gerar problemas em algumas situações: se o gene em questão é alterado ou inativado. Nessa caso, a criança terá os dois genes sem função e isso pode ocasionar doenças.
As doenças mais conhecidas incluem casos de fibrose cística, hemofilia A atrofia muscular espinhal III, hiperplasia adrenal congênita, deficiência de LPL, neoplasia endócrina múltipla tipo 2A e monocromacia haste autossômico recessivo, Síndrome de Prader-Willi (cromossomo 15 de origem materna) e diabetes neonatal transitória (cromossomo 6 de origem paterna).
Já as doenças sindrômicas mais frequentes que podem provocar retardo mental e podem estar associadas à dissomia uniparental são: Síndromes de Prader-Willi , Russel-Silver, Beckwith-Wiedemann e Angelman.
